solución de problemas de western blot

Resuelva sus problemas de western blot con estos consejos de solución de problemas, que cubren las causas comunes de ausencia de señal, fondo alto, bandas múltiples y más.

1. Sin señal
2. Fondo alto.
3. Varias bandas.
4. "Manchas" blancas desiguales en la mancha.
5. Puntos negros en la mancha.
6. Bandas blancas sobre una mancha negra.
7. El carril marcador de peso molecular es negro.

1. ¿Por qué no funciona mi Western blot??
2. ¿Por qué está manchado mi Western blot??
3. ¿Te lavas después de bloquear el Western blot??
4. ¿Qué causa la unión no específica en Western blot??
5. ¿Cómo puedo mejorar mis resultados de Western Blot??
6. ¿Por qué usamos leche en Western blot??
7. ¿Cuáles son los pasos del Western Blot??
8. ¿Puedes transferir una transferencia de Western?
9. ¿Cómo se confirma la transferencia de bandas de proteínas del gel a la membrana en el protocolo Western Blot??
10. ¿Cuánto tiempo puedes bloquear un Western blot??
11. ¿Puedes bloquear una mancha occidental durante el fin de semana??
12. ¿Cuántas veces puedes quitar una mancha occidental??

¿Por qué no funciona mi Western blot??

Si tiene muy poca proteína, si su anticuerpo primario no tiene alta afinidad o si su anticuerpo primario está en una dilución subóptima, no verá su proteína. Alternativamente, si carga demasiada proteína, su relación señal / ruido puede aumentar y causar dificultades en la visualización..

¿Por qué está manchado mi Western blot??

¿Cuál es el motivo de un frotis en una inmunotransferencia de tipo Western? Como puede ver en la tinción ponceau de la transferencia, hay un frotis que recorre los primeros 7 carriles. Las muestras son células madre embrionarias lisadas con tampón de muestra 2xLSB, pipeteado y hervido. ... Aparentemente, el frotis se debe a demasiadas células en un pozo.

¿Te lavas después de bloquear Western blot??

El bloqueo es un paso muy importante en la fase de inmunodetección de la transferencia Western porque evita la unión no específica del anticuerpo a la membrana de transferencia. Después del bloqueo, la mancha se enjuaga en tampón de lavado, generalmente TBST, con agitación suave y en volumen suficiente para mantener la mancha sumergida.. ...

¿Qué causa la unión no específica en Western blot??

Una de las causas más comunes de bandas inespecíficas es el bloqueo incompleto. Los tampones de bloqueo se utilizan para evitar que los anticuerpos primarios y secundarios se unan a la membrana o cualquier otra cosa que no sea la proteína de interés..

¿Cómo puedo mejorar mis resultados de Western Blot??

Solución

1. Reducir la concentración de anticuerpos primarios.
2. Disminuir la cantidad de proteína total cargada en el gel..
3. Ajustar las condiciones de bloqueo de la membrana.
4. Aumentar el número de lavados.
5. Verificar la especificidad del anticuerpo.
6. Transfiera con el anticuerpo secundario solo.
7. Si se desarrollan bandas, elija un anticuerpo secundario alternativo.

¿Por qué usamos leche en Western blot??

El bloqueo es un paso muy importante de la transferencia Western, ya que evita que los anticuerpos se unan a la membrana de manera inespecífica. El bloqueo a menudo se hace con 5% de BSA o leche en polvo descremada diluida en TBST para reducir el fondo. ... El anticuerpo se puede diluir en un tampón de lavado, como PBS o TBST.

¿Cuáles son los pasos del Western Blot??

Cinco pasos están involucrados en el procedimiento de transferencia de Western y el ensayo de detección, a saber, transferencia, bloqueo, incubación primaria de anticuerpos, incubación secundaria de anticuerpos y detección de proteínas y análisis de transferencia Western.

¿Puedes transferir una transferencia de Western?

Sin embargo, con el paso del tiempo, existe el riesgo de una transferencia excesiva (desprendimiento, soplado) de las proteínas a través de la membrana, especialmente para pesos moleculares más bajos (<30 kDa) cuando se utilizan membranas con un tamaño de poro mayor (0,45 µm). Flujo de trabajo de electrotransferencia de proteína en tanque / húmedo para transferencia Western.

¿Cómo se confirma la transferencia de bandas de proteínas del gel a la membrana en el protocolo Western Blot??

Protocolo de transferencia de proteínas

1. Prepare la membrana de PVDF humedeciéndola en metanol durante 30 segundos y luego sumergiéndola brevemente en agua destilada seguido de tampón de transferencia 1X. ...
2. Sumerja los papeles de filtro y las esponjas en el tampón de transferencia durante 10 minutos antes de montar el sándwich de transferencia..

¿Cuánto tiempo puedes bloquear un Western blot??

Generalmente, el tiempo máximo de bloqueo no debe exceder las 2 horas a temperatura ambiente o se pueden intercambiar proteínas de la membrana. Diluir el anticuerpo primario a la concentración / dilución recomendada en solución de bloqueo fresca (TBS y / o PBS (tabletas de PBS 524650-1EA) / leche en polvo descremada al 3%).

¿Puedes bloquear una mancha occidental durante el fin de semana??

Los anticuerpos de título fuerte funcionan mejor en una incubación corta y los anticuerpos de neumáticos débiles requieren una incubación más prolongada (a concentraciones más altas). Dejar la mancha en el búfer de bloqueo durante la noche o durante el fin de semana a 4 ° C no duele.

¿Cuántas veces puedes quitar una mancha occidental??

Además, mientras intentamos eliminar los anticuerpos primarios, es importante tener en cuenta que existe la probabilidad de que pueda perder parte de la proteína que ha adherido o transferido a la membrana, por lo que es aconsejable no quitar la membrana más de una vez..